De kloon isoleren
In het algemeen wordt gekloond om de kloon van een bepaald gen of een DNA-sequentie van belang te verkrijgen. De volgende stap na het klonen is daarom die kloon te vinden en te isoleren tussen andere leden van de bibliotheek. Als de bibliotheek het hele genoom van een organisme omvat, zal ergens binnen die bibliotheek de gewenste kloon zijn. Er zijn verschillende manieren om het te vinden, afhankelijk van het specifieke gen in kwestie. Meestal wordt een gekloond DNA-segment dat homologie vertoont met het gezochte gen, gebruikt als sonde. Als er bijvoorbeeld al een muisgen is gekloond, dan kan die kloon worden gebruikt om de equivalente menselijke kloon uit een menselijke genomische bibliotheek te vinden. Bacteriekolonies die een bibliotheek vormen, worden gekweekt in een verzameling petrischalen. Vervolgens wordt een poreus membraan over het oppervlak van elke plaat gelegd en cellen hechten zich aan het membraan. De cellen zijn gescheurd en DNA is gescheiden in enkele strengen - allemaal op het membraan. De sonde is ook gescheiden in afzonderlijke strengen en gelabeld, vaak met radioactief fosfor. Vervolgens wordt een oplossing van de radioactieve sonde gebruikt om het membraan te baden. Het enkelstrengige sonde-DNA hecht zich alleen aan het DNA van de kloon dat het equivalente gen bevat. Het membraan wordt gedroogd en tegen een vel stralingsgevoelige film geplaatst, en ergens op de films zal een zwarte vlek verschijnen die de aanwezigheid en locatie van de gewenste kloon aankondigt. De kloon kan dan worden opgehaald uit de originele petrischalen.
genetica: Recombinante DNA-technologie en de polymerase-kettingreactie
Technische vooruitgang heeft een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van genetisch begrip. In 1970 Amerikaanse microbiologen Daniel Nathans
DNA sequentie
Zodra een DNA-segment is gekloond, kan de nucleotidesequentie ervan worden bepaald. De nucleotidesequentie is het meest fundamentele kennisniveau van een gen of genoom. Het is de blauwdruk die de instructies bevat voor het bouwen van een organisme, en geen begrip van genetische functie of evolutie kan compleet zijn zonder deze informatie te verkrijgen.
Toepassingen
Kennis van de sequentie van een DNA-segment heeft vele toepassingen en enkele voorbeelden volgen. Ten eerste kan het worden gebruikt om genen, DNA-segmenten te vinden die coderen voor een specifiek eiwit of fenotype. Als een gebied van DNA is gesequenced, kan het worden gescreend op karakteristieke kenmerken van genen. Open leesframes (ORF's) - lange sequenties die beginnen met een startcodon (drie aangrenzende nucleotiden; de sequentie van een codon dicteert de productie van aminozuren) en worden niet onderbroken door stopcodons (behalve één bij hun beëindiging) - stellen een eiwit coderend gebied. Menselijke genen grenzen ook over het algemeen aan zogenaamde CpG-eilanden - clusters van cytosine en guanine, twee van de nucleotiden waaruit DNA bestaat. Als bekend is dat een gen met een bekend fenotype (zoals een ziektegen bij mensen) zich in het chromosomale gebied bevindt waarvan de sequentie is bepaald, worden niet-toegewezen genen in het gebied kandidaten voor die functie. Ten tweede kunnen homologe DNA-sequenties van verschillende organismen worden vergeleken om evolutionaire relaties zowel binnen als tussen soorten uit te zetten. Ten derde kan een gensequentie worden gescreend op functionele regio's. Om de functie van een gen te bepalen, kunnen verschillende domeinen worden geïdentificeerd die gemeenschappelijk zijn voor eiwitten met een vergelijkbare functie. Zo worden bepaalde aminozuursequenties binnen een gen altijd gevonden in eiwitten die een celmembraan overspannen; dergelijke aminozuuruitrekkingen worden transmembraandomeinen genoemd. Als een transmembraandomein wordt gevonden in een gen met een onbekende functie, suggereert dit dat het gecodeerde eiwit zich in het celmembraan bevindt. Andere domeinen kenmerken DNA-bindende eiwitten. Er zijn verschillende openbare databases met DNA-sequenties beschikbaar voor analyse door elke geïnteresseerde persoon.
